近日，中国科学院南海海洋研究所热带海洋生物资源与生态重点实验室（LMB）研究员王晓雪团队与上海细胞治疗集团合作，以细胞/基因治疗临床需求为导向，开发了一种利用毒素-抗毒素系统作为克隆筛选标记的小骨架质粒载体并命名为太质粒（Tiniplasmid）。这一毒素-抗毒素（TA）系统应用方面的最新成果发表在在微生物工程应用类经典期刊Metabolic Engineering上。博士研究生陈喆为论文的第一作者，副研究员姚建云为论文的共同第一以及共同通讯作者，王晓雪为论文的主要通讯作者。
抗生素抗性基因作为最重要的筛选标记在DNA克隆，质粒发酵以及预防菌株污染等方面广泛应用，但由于抗生素使用引发的安全性问题，抗性基因在食品与药品等领域的使用受到严格限制，尤其是在基因治疗和DNA疫苗研发方面。鉴于上述原因，研发高效且安全的筛选系统来取代抗性基因的使用在临床研究中显得尤为重要。TA系统由具有明显细菌毒性的毒素以及能够拮抗其毒性的抗毒素编码组成，具有开发成新型筛选系统的应用潜力。本研究中，我们将携带诱导型启动子的毒素基因整合到工程菌的基因组上，通过诱导毒素来筛选和生产携带抗毒素的重组太质粒。通过测定不同家族毒素的杀菌活性来评估其作为筛选标记的潜力。研究发现ParE家族毒素具有明显的杀菌活性，且其对应的抗毒素能够通过直接的蛋白-蛋白相互作用来拮抗其细胞毒性，该TA系统与抗生素系统具有相当的克隆筛选效率以及DNA质粒得率。
以质粒为载体的细胞基因治疗与病毒载体相比，具有安全性、工艺简单、低成本等优势，但质粒骨架的大小对真核细胞转基因效率有很大的影响，缩小质粒骨架对于提升转基因效率具有重要意义。综合毒素杀菌能力以及抗毒素大小的优势，我们选取了珊瑚共生菌来源的TA系统Rs_0636/Rs_0637作为目标TA系统，成功研发了最小骨架小于500bp的无抗太质粒系统，在本系统太质粒中抗毒素基因仅编码50个氨基酸（153 bp），太质粒比常规的pUC57质粒骨架小1000 bp。在上海细胞治疗集团开展的转座子介导的真核细胞转基因测试中，基于该系统开发的太质粒在转基因表达效率方面比目前商业化的载体相比更具优势，且通过安全性评估也表明该系统在基因治疗和DNA疫苗的研发中具有非常好的应用潜力。
课题组前期在质粒编码的TA 系统的功能研究方面取得了一系列成果，并实现了相关专利的转化。
以上研究工作得到了国家自然科学基金项目、上海市浦江计划、科技基础资源调查专项、国家重点研发计划等的资助。
图1. 利用毒素-抗毒素系统Rs_0636/ Rs_0637作为筛选标记在真核转基因表达中的应用
相关论文信息：Zhe Chen#, Jianyun Yao#*, Pingjing Zhang, Pengxia Wang, Songwei Ni, Tao Liu, Yi Zhao, Kaihao Tang, Yan Sun, Qijun Qian, Xiaoxue Wang* (2023) Minimized antibiotic-free plasmid vector for gene therapy utilizing a new toxin-antitoxin system. Metabolic Engineering. 79, p86-96.
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