9月26日，中国科学院深圳先进技术研究院合成生物学研究所Howard Chou团队在Metabolic Engineering上发表了题为Combinatorial optimization and spatial remodeling of CYPs to control product profile的研究成果。在该研究中，研究人员通过组合优化策略，在酿酒酵母中成功构建了细胞色素P450氧化酶(CYP)和细胞色素P450氧化酶还原酶(CPR)的氧化网络，实现特定三萜皂苷quillaic acid（QA）的高效生物合成。
QA是多种皂树皂苷的苷元，而皂树皂苷已经被开发成多种疫苗的佐剂。本研究通过迭代筛选氧化还原库中的CYP-CPR组合，解决了从 -amyrin（BA）到QA生物合成过程中三个不同位点上六步氧化反应的平衡问题；并通过工程化改造酿酒酵母的内质网和减小不同CYP间的空间距离，进一步提高了CYP网络的氧化效率。在多达47个潜在氧化产物的产物谱中，QA的比例达到86%，产量达到2.23 g/L。该研究所提出的CYP氧化网络概念为调控多种CYP参与的复杂氧化通路生物合成提供了新的思路，并为控制产物的专一性提供了新的方法。
以QS-21、QS-7、QS-17为代表的皂树皂苷已经作为天然免疫佐剂被广泛应用于带状孢疹、疟疾、和Covid-19等疫苗中。而在皂树中发现的58种三萜皂苷中，有49种皂苷的苷元为QA。构建高产QA的酵母细胞工厂可以为高效生物合成QS-21等天然免疫佐剂奠定基础。在QA的生物合成中，需要将BA的C-16、C-23、和C-28分别氧化为羟基、醛基、和羧基。高效生物合成QA需要实现这三个位点的氧化平衡，否则会出现46种过氧化或不完全氧化的副产物（图一），而过多的副产物不仅降低目标化合物产量，也增加纯化成本。
在本研究中，研究人员首先构建了可以生产BA的底盘菌株，并利用该底盘筛选了12个不同的CYP以确定最优的候选基因用于QA的生物合成。实验发现CYP716A12在氧化BA的C-28生成Oleanolic acid (OA)时效率最高，CYP716A262氧化OA生成EA时的效率最高，CYP714E19主要氧化OA生成C-23羟基产物hederagenin（HE），而CYP72A567主要氧化OA生成C-23醛基产物gypsogenin （GY）和C-23羧基产物gypsogenic acid（GA）。前期文献报道CYP716A262可以直接将BA的C-16和C-28分别氧化成羟基和羧基得到echinocystic acid（EA）。有别于传统代谢工程思路去增强CYP716A262基因的表达，本研究通过迭代筛选CYP发现了CYP氧化的网络效应。相较于同时表达CYP716A262和CYP716A12，表达两个拷贝的CYP716A262的EA产量要低32.9%（图三）。
研究人员随后考察了CPR对CYP网络的影响。在考察了不同的CYP-CPR组合后，发现CPR不仅对氧化产物的产量产生影响，并会改变产物谱中不同产物的比例（图二）。研究人员同时发现在表达植物的CYP时，来源自动物或者真菌的CPR有时比植物的CPR能够更好的提高目标化合物的产量和比例。CPR筛选实验发现CrCPR与CYP716A12组合时效果最好。通过在BA高产底盘中表达CrCPR、CYP716A12、CYP716A262、和CYP72A567到了菌株yQA11。摇瓶发酵其QA的产量仅为21.3 mg/L，并且有大量的前体OA和EA积累。此外通过迭代筛选也发现，SaCPR与CYP716A262和CYP72A567的组合较佳。
虽然强化代谢流通量是提高产量的有效手段，但是研究人员发现过表达酿酒酵母内源的erg1只能增加双位点的氧化产物如EA和HE的产量积累，并不能增加QA的产量，从而证明单纯增加前体供应对于三位点氧化产物的积累影响较小（图三）。
研究人员随后通过再次迭代筛选候选CYP和CPR，发现表达两个拷贝的CYP72A567和一个拷贝的CYP714E19时QA的产量要高于表达三个拷贝的CYP72A567（图四），再一次证明了CYP氧化的网络效应存在。而在CYP网络中引入能与CYP72A567和CYP716A262更好组合的SaCPR，也可以进一步提高QA的产量。通过在菌株yQA11中再增加一个拷贝的CYP72A567，并引入CYP714E19和SaCPR得到菌株yQA12P，QA的产量增加了350%，达到95.9 mg/L。
研究人员随后发现在CYP网络中引入来自拟南芥的MSBP1能够降低不同CYP在内质网上的空间距离，并减少因底物扩散导致的中间体积累，从而将QA的产量从95.9 mg/L提高到172 mg/L（图五）。最后通过增加辅因子NADPH的供给和过表达酵母内源基因ice2以增加内质网的空间面积，QA的产量达到258 mg/L。通过在1 L的发酵罐中进行分批补料发酵，QA的产量达到2.23 g/L（图六），比前期报道的产量高7倍。
该论文的第一作者是杨加增助理研究员，Howard Chou正高级工程师为本文的通讯作者。罗小舟研究员和Jay Keasling教授也为本研究提供了资源支持，并在实验设计和论文写作上提供了指导。 这项工作得到了国家重点研发计划（2020YFA0907700），国家自然科学基金（22050410274和32101183）、比尔及梅琳达 盖茨基金会（INV-025841）、广东省基础与应用基础研究基金（2021B1515020049和2023A1515011338）、中国博士后基金（2020M682988）和深圳合成生物学创新研究院的支持。
图五：减小CYP在内质网上的空间距离提高QA产量
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