4月13日，中国科学院深圳先进技术研究院司同课题组在国际学术期刊ACS Catalysis在线发表研究论文“RhlA Exhibits Dual Thioesterase and Acyltransferase Activities during Rhamnolipid Biosynthesis”。鼠李糖脂（Rhamnolipid，RL）是一种最具应用潜力的生物表面活性剂。RhlA酶是影响RL产物结构的关键因素，但其序列-结构-功能关系尚不清楚，且催化机制存在争议。研究团队依托深圳合成生物研究重大科技基础设施，首次解析了RhlA的蛋白质晶体结构，意外的发现游离3-羟基脂肪酸可以作为RL生物合成过程的中间体，证实了RhlA具有双重硫酸酯酶和酰基转移酶活性。通过结合半理性设计与高通量质谱筛选，团队获得了底物选择性显著改变的RhlA突变体，这一研究为未来鼠李糖脂产品高效、特异性工业化生产提供机制基础和技术借鉴。本文的第一作者是课题组助理研究员唐婷博士，通讯作者为司同研究员和张建志助理研究员。
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文章链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscatal.3c00046
生物表面活性剂是由动植物和微生物生成的表面活性分子；相较于化学合成表面活性剂，它们的结构更加多样，并且具有良好的环境兼容性。因此，生物表面活性剂可以作为洗涤剂、乳化剂、润湿剂、发泡剂和分散剂等重要化工产品的绿色替代原料。鼠李糖脂具有显著降低流动相间表/界面张力的能力，且具有优异的起泡、乳化和絮凝作用，同时具备稳定性、低毒性和生物可降解性等优点。因此，在石油、环境、农业、食品和医药等领域具有广泛的应用前景。美国Jeneil公司研制的生物基鼠李糖脂产品于2004年荣获美国联邦环保署颁发的“总统绿色化学挑战奖”。
尽管如此，鼠李糖脂的大规模应用仍受制于高昂的生产成本，其中约70%为分离成本；一个重要原因是生物合成的鼠李糖脂中存在大量结构相似、难以分离的同系物。深入研究和改造鼠李糖脂生物合成途径，有助于实现目标同系物的高效特异性生产，从而降低分离成本，促进工业生产和市场推广，实现对合成表面活性剂的绿色替代。
RhlA是影响RL分子结构多样的关键因素。RhlA催化合成RL的疏水模块——3-羟基烷酰基-3-羟基烷酸（HAA），该酶的底物选择性决定了疏水模块中脂肪链的长度和不饱和度，进而影响RL的理化性质和生物活性。然而，由于实验手段的限制，RhlA底物选择性的机制解析和工程改造尚处于起步阶段。例如，迄今为止尚无RhlA蛋白质晶体结构的报道，而同源结构建模指导下的半理性设计未能有效改变RhlA底物选择性。另外，鼠李糖脂同系物之间仅存在精细的分子结构差异，定性和定量分析需要依赖色谱-质谱联用等方法，其较低的分析速度（30分钟/样品）也限制了定向进化策略的应用。
为克服这些局限，本研究通过X射线晶体学方法首次解析了铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)来源RhlA的蛋白质结构，揭示了RhlA具有α/β水解酶折叠结构。出乎意料的是，除Ser-His-Asp催化中心附近经典的配体结合口袋1外，研究人员还发现了另外一个配体结合口袋2，该口袋中结合有游离的3-羟基脂肪酸，推测可能是反应中间体。
综合应用同位素标记、体外学表征、以及QM/MM计算模拟手段，研究人员验证了RhlA在体外反应中具有硫酸酯酶活性，可以催化酰基-ACP（acyl carrier protein, 酰基载体蛋白）底物水解生成游离3-羟基脂肪酸。同时，团队发现游离3-羟基脂肪酸也可以作为酰基受体，在RhlA酰基转移酶活性的催化作用下与酰基-ACP供体形成HAA，但是该路径在整体反应中的贡献占比较小。
研究人员进一步应用半理性设计，针对两个结合口袋中的13个关键氨基酸残基位点构建了定点饱和突变文库，应用高通量MALDI-TOF质谱方法筛选了上千株突变株，最终得到了RhlA底物选择性显著变化的9个突变体，并发现不同结合口袋的突变对于HAA中两个脂肪链的长度具有不同的调节作用。团队对RhlA的三个典型突变体（Met37Phe、Phe43His和Ala101Met）开展了重组表达、蛋白纯化与体外酶动力学分析，发现kcat是决定发酵液中不同RL同系物比例的关键参素。
值得指出的是，尽管本研究解析了RhlA酶一个可能的反应路径，但由于未获得RhlA和酰基-ACP底物的共结晶结构，RhlA的催化机理仍有待进一步阐明。
该成果得到国家重点研发计划（2020YFA090023和2021YFA0910800）、国家自然科学基金（32071428）、广东省基础与应用基础研究基金（2022A1515110680）、中科院战略先导项目（XDB0480000）、深圳华大研究院开发基金（BGIRSZ20210003）及深圳合成生物学创新研究院的支持。作者特别致谢上海同步辐射光源和深圳合成生物研究重大科技基础设施对于X-射线晶体衍射和高通量质谱筛选研究的帮助。
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