维生素B5（又称D-泛酸）在细胞中参与碳水化合物、脂肪和蛋白质的代谢，是人体必需的维生素之一，被广泛应用于医药、饲料、食品、保健等领域。D-泛酸目前主要通过化学-酶法生产，该过程涉及大量含氰废水的处理，随着人们对环境保护的重视，该方法面临着巨大的挑战。微生物细胞工厂因其绿色环保的特点，是实现D-泛酸生产可持续发展的突破口。
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文章链接：https://doi.org/10.1021/acs.jafc.3c01082
武汉大学刘天罡教授与中科院深圳先进技术研究院马田副研究员合作在Journal of Agricultural and Food Chemistry上发表题为“Metabolic Engineering of Saccharomyces cerevisiae for Vitamin B5 Production”的研究成果。该研究在酿酒酵母中构建了D-泛酸的高效合成途径，并通过系统代谢工程对合成途径进行优化，最终使用廉价培养基且无前体、无诱导剂、无抗生素添加，实现4.1 g/L D-泛酸的合成，是目前报道酿酒酵母从葡萄糖从头合成D-泛酸的最高产量。
图1. 本研究涉及的D-泛酸生物合成途径
D-泛酸合成途径关键酶的筛选及适配。该研究首先将D-泛酸的生物合成途径设计为三个模块：β-丙氨酸合成模块、D-泛解酸合成模块和两者的缩合模块，过程涉及7步关键酶（图1）。将来自细菌、酵母、真菌、藻类、植物、动物等不同物种来源的功能酶以模块为单位进行筛选，并通过组合筛选获得最佳的元件适配组合。在酿酒酵母中构建了D-泛酸异源合成途径，并实现利用基本碳源且无前体添加合成D-泛酸。
D-泛酸生物合成途径的优化。为了进一步强化D-泛酸合成途径，作者对三个模块的基因进行拷贝数的优化，发现D-泛解酸合成模块、β-丙氨酸合成模块和前体缩合模块拷贝数为3:1:2时，工程菌合成泛酸的能力最强。
另一方面，D-泛酸合成途径中存在多个竞争途径，作者围绕丙酮酸与酮异戊酸两个关键中间代谢物对不同竞争途径进行了删减或削弱。通过对竞争途径关键基因的敲除，作者发现leu4、bat1、gpd1和gpd2四个潜在D-泛酸增产的有效位点。随后，通过过表达pos5平衡细胞内的氧化还原力，过表达mae1增加前体丙酮酸，获得D-泛酸高产菌株。
D-泛酸高产菌的发酵优化。在以上研究中，关键基因的表达受半乳糖诱导型启动子调控，作者将关键调控基因gal80敲除，使基因的过表达仅通过葡萄糖调控，获得工程菌DPA171。在发酵罐中对菌株DPA171进行发酵条件优化，通过控制补料阶段乙醇的浓度在5 g/L以下，在不添加诱导剂、前体、抗生素等成分的条件下，以葡萄糖为碳源从头合成，实现4.1 g/L D-泛酸的合成。
图2. 酿酒酵母细胞工厂高产D-泛酸
综上，本研究首次在酿酒酵母中构建了完整的D-泛酸异源合成途径，并进行系统代谢工程实现以葡萄糖为碳源从头合成D-泛酸，为构建维生素类细胞工厂提供了指导。
本论文以武汉大学硕士生郭加璇为第一作者，以刘天罡教授和马田副研究员为共同通讯作者。该研究工作得到国家重点研发计划和武汉合生科技有限公司支持。
通讯作者简介：
马田博士，中国科学院深圳先进技术研究院副研究员。主要致力于探索微生物高效合成的代谢机理及工程手段以实现目标生物源药物的绿色制造。研究成果以第一作者或通讯作者发表在Nature Communications、Metabolic Engineering等。转化成果被评为2018年湖北十大科技事件、2019年湖北省科技进步一等奖。
课题组面向微生物绿色制造方向，现招聘博士后和研究助理，以微生物学、生物化学、分子生物学背景优先，欢迎感兴趣的同志投递简历至邮箱tian.ma@siat.ac.cn。
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